Les frères Blues sont deux délinquants stoïques, imperturbables, flegmatiques et drôles, reconnaissables à leur look caractéristique à base de Ray-Ban Wayfarer pour Jake et de lunettes noires pour Elwood, costume noir avec 3 boutons et une fente à l'arrière pour Elwood, 2 boutons et 2 fentes pour Jake afin de renforcer leur physionomie), chapeau Trilby noir, chaussures noires mais chaussettes blanches, chemise blanche à fine cravate noire et à la discordance de leurs carrures respectives. Ils se retrouvent lorsque « Joliet » Jake (incarcéré pour vol à main armée) est libéré de la « prison Joliet » de Joliet dans l'État d'Illinois sous la responsabilité de son frère Elwood. Ils apprennent que l'orphelinat catholique où ils ont été élevés est surendetté et va être rasé, à moins de payer les arriérés de taxes foncières dans un très bref délai administratif de 11 jours, au bureau administratif des impôts de Chicago, au nom de la mère supérieure « la Pingouine ».
Les Blues Brothers partent en « mission pour le Seigneur » et décident de reconstituer leur ancien talentueux groupe de musique dispersé avec le temps pour repartir en tournée musicale à base de rhythm and blues noir américain, afin de récolter honnêtement la somme de 5 000$ nécessaire à la survie de l'orphelinat. Leur conduite insouciante dans leur vieille voiture de police Bluesmobile (Dodge Monaco 1974) attire rapidement l'attention de toute la police de Chicago, d'Illinois et des États-Unis.
Leur tournée musicale est truffée de nombreuses péripéties et de nombreux morceaux cultes de la musique populaire américaine. Le duo se fait de nombreux ennemis, dont le Parti nazi américain, un tenancier, une équipe de chanteurs country, la police de Chicago, très vite secondée par celles de tout l'État de l'Illinois, auxquelles s'ajoutent les forces d'interventions spéciales, l'armée et une mystérieuse femme (qui se trouve finalement être l'ancienne fiancée de Jake, rendue hystérique par son abandon et qui tente de l'assassiner pour se venger par tous les moyens possibles, dont un bazooka, un lance flammes, un fusil d'assaut M16...).
Leur mission spectaculaire est jalonnée de très nombreuses courses poursuites en voiture et de très nombreux accidents : plus de soixante véhicules de police sont anéantis et treize Bluesmobiles sont nécessaires pour les scènes de carambolage.